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1.3.4 卵白蛋白消化产物对H₂O₂诱导的卵白Caco-2细胞内ROS的清除作用

细胞内ROS含量的测定采用文献中报道的DCFH-DA荧光探针法，并稍作修改。蛋白道消细胞孵育以及试验设置同1.3.3.3节，体外经过最后一步H₂O₂孵育6h后，模拟将96孔板中上清液吸弃，胃肠物用PBS清洗细胞后，化产化活每孔加入20μLDCFH-DA溶液，抗氧放入37℃、性及5%CO₂培养箱中孵育20min后，其结用PBS清洗细胞3次后加入DMEM，构表用酶标仪测定其在激发波长485nm、卵白发射波长525nm下的蛋白道消荧光强度。

1.3.5 体外模拟胃肠道消化产物（＜1ku）肽序列鉴定

1.3.5.1 肽序列鉴定

利用高效液相色谱-串联质谱对体外模拟胃肠道消化产物（＜1ku）进行肽序列鉴定。体外色谱条件：流动相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）；流速：300nL/min；洗脱程序：5%～35%B（60min），模拟35%～75%B（4min），胃肠物75%B（10min）。

1.3.5.2 肽的合成

通过高效液相色谱-串联质谱鉴定的肽，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，纯度达到98%以上。

1.3.6 合成肽的体外抗氧化活性

1.3.6.1 合成肽的ABTS⁺·清除能力测定

方法同1.3.2.1节。

1.3.6.2 合成肽的ORAC测定

方法同1.3.2.2节。

1.4 数据统计分析

试验结果用平均值±标准差表示，重复3次。用SPSS18.0软件对数据进行显著性分析，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 卵白蛋白及其消化产物的体外抗氧化活性

2.1.1 ABTS⁺·清除能力测定

蛋白以及蛋白产物的ABTS自由基清除活性结果如图1所示。可以看出，卵白蛋白及其消化产物对ABTS自由基的清除能力均具有浓度依赖性，大小顺序依次为：体外模拟胃肠道消化产物＜1ku、体外模拟胃肠道消化产物1～3ku、体外模拟胃肠道消化产物3～10ku、卵白蛋白，说明卵白蛋白经过体外模拟胃肠道消化后，其消化产物的ABTS自由基清除活性均有不同程度的增强，这一结论与文献中已有的报道相符，说明蛋白经过体外模拟胃肠道消化后，产生了新的具有抗氧化活性的肽段或氨基酸。可以发现，分子质量越小的组分表现出越强的ABTS自由基清除活性，其中，分子质量＜0.05），最高浓度清除率达49.48%，Foh等以罗非鱼为原料，得到蛋白水解物，同样发现了分子质量＜1ku的组分ABTS自由基清除能力最强，与其它组分存在显著性差异（P＜0.05），最高浓度清除率达49.48%，Foh等以罗非鱼为原料，得到蛋白水解物，同样发现了分子质量＜1ku的组分清除ABTS自由基的能力最强，高于分子质量＜3ku的组分和分子质量＜5ku的组分。

2.1.2 ORAC测定

蛋白以及蛋白产物的氧自由基吸收能力结果如图2所示。ORAC值最大的组分仍然为体外模拟胃肠道消化产物（5ku的组分仍然为体外模拟胃肠道消化产物（＜1ku），依次为体外模拟胃肠道消化产物（1～3ku）、体外模拟胃肠道消化产物（5～10ku）、卵白蛋白。其中体外模拟胃肠道消化产物（＜1ku）和体外模拟胃肠道消化产物（1～3ku）的ORAC值分别为1.21μg/mLTE/μg/mL和2.07μg/mLTE/μg/mL，高于Trolox的ORAC值（1μg/mLTE/μg/mL）。这一结果与上述结果一致，说明经过体外模拟胃肠道消化，卵白蛋白被酶解，释放出新的抗氧化肽段，抗氧化肽段表现出更强的氧自由基吸收能力，并且分子质量越小的肽段，ORAC值越大。这一结果与文献中已有的报道相符：Vilcacundo等以藜麦蛋白为原料，经过体外模拟胃肠道消化后，分子质量＜5ku的组分ORAC值高于分子质量＞5ku的组分。

2.2 卵白蛋白及其消化产物的细胞抗氧化活性

2.2.1 H₂O₂诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型的建立

不同浓度的H₂O₂对Caco-2细胞存活率的影响如图3所示。H₂O₂容易通过细胞膜，在细胞内产生高活性自由基，从而引发机体氧化应激，最终导致细胞损伤或凋亡。当H₂O₂浓度由400μmol/L增加到900μmol/L时，细胞存活率逐渐降低，与未经H₂O₂处理组（对照组）存在显著性差异，当H₂O₂浓度在700μmol/L时，细胞存活率为48%，约为对照组细胞存活率的50%，当H₂O₂浓度在900μmol/L时，细胞存活率为13%，细胞氧化损伤过于严重，此时蛋白及其产物难以表现出对细胞的保护作用，综合以上因素，选用700μmol/L的H₂O₂构建细胞氧化损伤模型，探究体外模拟胃肠道消化的卵白蛋白产物的细胞抗氧化活性。

2.2.2 卵白蛋白消化产物对Caco-2细胞氧化损伤的保护作用

卵白蛋白体外模拟胃肠道消化产物对H₂O₂诱导的细胞氧化应激损伤的保护作用结果如图4所示。按照2.2.1节构建得到的细胞氧化损伤模型，H₂O₂处理组（损伤组）细胞存活率约为对照组的50%，与对照组存在显著性差异（P＜0.05）。在H₂O₂处理细胞之前，用不同质量浓度的肽（0.01，0.1，1mg/mL）处理细胞，体外模拟胃肠道消化产物（3～10ku）和体外模拟胃肠道消化产物（1～3ku）细胞存活率与损伤组细胞没有显著性差异（P＞0.05），对细胞没有氧化损伤的预先保护作用。当体外模拟胃肠道消化产物（＜1ku）质量浓度为0.01mg/mL时，细胞存活率与损伤组细胞没有显著性差异（p＞0.05），随着产物浓度的升高，细胞存活率逐渐提高，与损伤组存在显著性差异（P＜0.05），表明体外模拟胃肠道消化产物（＜1ku）对H₂O₂诱导的细胞氧化应激损伤具有保护作用。值得注意的是：由于模型中所采用的细胞为人结肠癌细胞系（Caco-2细胞），Caco-2细胞经分化后类似小肠细胞并可表达成熟的小肠细胞的特征，进而该细胞被广泛用于吸收模型研究。推测卵白蛋白经过体外模拟胃肠道消化后，被Caco-2细胞吸收，在细胞内发挥保护作用，从而提高细胞存活率。并且，在未经H₂O₂处理、消化质量浓度为1mg/mL时，细胞存活率与对照组相比表现为既不升高也不降低，与对照组无显著性差异（P＞0.05），表明消化产物对Caco-2细胞既没有毒性作用，也不促进细胞增殖。

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